การถ่ายยีนและวิเคราะห์การแสดงออกของยีนควบคุมการสังเคราะห์ แอนโทไซยานินในข้าว

Abstract

Anthocyanins are water soluble pigments, classified in the flavonoid group and have high antioxidant activity. They can be found in the tissues of plants, including pericarp of colored rice. Anthocyanin biosynthesis in rice involves two major classes of genes, the regulatory genes and the structural genes. In this study, transformation of genes controlling anthocyanin synthesis into rice was studied for complementary effects of two regulatory genes to be used as markers for callus selection in rice transformation. Transformation of OsC1 and OsB2 genes which were cloned from Thai black rice, Kham and co-transformation of both genes into red pericarp rice, Kasalath were investigated. The results showed that transgenic rice plants containing OsC1, OsB2, and both OsC1 and OsB2 genes were 8, 59 and 10 plants respectively. The phenotypic traits of OsC1 transgenic rice were red in some tissues including leaf sheath, node, apiculus and awn. The high accumulation of purple pigments in stigma were also found. The phenotypic traits of OsB2 transgenic rice were similar to those of wild-type but developing and mature seeds showed purple pigmentation on their pericarp. Transgenic rice containing both genes, had similar phenotypes to OsC1 transgenic rice. However, the seeds accumulated purple pigment similar to those of OsB2 transgenic rice. Segregation analysis of OsC1 and OsB2 transgenic rice showed 3 : 1 and 15 : 1 ratios in T1 generation, possibly suggesting one or two gene insertion sites in the rice genome. Transgenic rice plants containing both genes showed the ratio of 9 : 3 : 3 : 1 in T1 generation , indicating two insertion sites of transgenes in the rice genome. The cross between T1 generation plants of OsC1 transgenic plants as a female plant and OsB2 transgenic plants as a male plant produced 8 F1 hybrids which had both transgenes and high accumulation of anthocyanins in purple seedlings. In addition, semi-quantitative RT-PCR analysis revealed that overexpression of OsC1, OsB2 and important structural genes in anyhocyanin biosynthetic pathway was found in T1 seedlings of transgenic plants with OsC1, OsB2 and both genes as well as F1 hybrids. Mature seeds of OsB2 transgenic rice plants in T1 contained higher anthocyanin contents and antioxidant activity than those of untransformed plants and transgenic plants with OsC1 and both genes. The results of this study can be applied for use of regulatory genes as selectable markers in the process of rice transformation into calli and development of marker genes for improvement of elite rice with high anthocyanins in the future.

แอนโทไซยานินเป็นรงควัตถุที่ละลายน้ำได้ จัดอยู่ในกลุ่มฟลาโวนอยด์ และมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระสูงสามารถพบสารดังกล่าวได้บริเวณเนื้อเยื่อของพืช เช่น เมล็ดข้าวที่มีสี การสังเคราะห์แอนโทไซยานินมียีนที่เกี่ยวข้องหลัก 2 ชนิด คือ ยีนควบคุมและยีนโครงสร้าง ในงานวิจัยนี้ได้ศึกษาการถ่ายยีนควบคุมการสังเคราะห์แอนโทไซยานินเข้าสู่ข้าว ศึกษาการทำงานร่วมกันของยีนควบคุมสองชนิดในข้าว และตรวจสอบการใช้ยีนควบคุมเป็นยีนเครื่องหมายในการคัดเลือกแคลลัสในขั้นตอนการถ่ายยีน จากการศึกษาการถ่ายยีนที่โคลนได้จากข้าวดำพันธุ์ก่ำ ได้แก่ ยีน OsC1 และ OsB2 และถ่ายยีน OsC1, OsB2 และ OsC1 ร่วมกับยีน OsB2 เข้าสู่ข้าวพันธุ์ Kasalath ที่มีเยื่อหุ้มเมล็ดสีแดง พบว่ามีต้นข้าวที่ได้รับยีนจำนวน 8, 59 และ 10 ต้น ตามลำดับ โดยฟีโนไทป์ของต้นข้าวที่ได้รับยีน OsC1 และยีนร่วมจะมีลักษณะกาบใบ ข้อ เขี้ยวกันแมลง ปลายกลีบดอกใหญ่ และหางข้าวเป็นสีแดง นอกจากนี้ยังพบว่ายอดเกสรเพศเมียเป็นสีม่วง ส่วนต้นข้าวที่ได้รับยีน OsB2 มีฟีโนไทป์เหมือนกับต้นข้าวที่ไม่ผ่านการถ่ายยีน แต่จะพบว่าเมล็ดอ่อนและเมล็ดแก่มีการสะสมรงควัตถุสีม่วง และข้าวที่ได้รับยีน OsC1 ร่วมกับ OsB2 มีฟีโนไทป์ของต้นเหมือนกับต้นที่ได้รับยีน OsC1 เมล็ดมีการสะสมรงควัตถุสีม่วงเหมือนต้นที่ได้รับยีน OsB2 การวิเคราะห์ต้นข้าวดัดแปลงพันธุกรรมรุ่น T1 ที่ได้รับการถ่ายยีน OsC1, OsB2 และยีนร่วม ไปสู่รุ่นลูก พบว่ามีการกระจายตัวของยีนได้อัตราส่วน 3 : 1 และ 15:1 ในต้นข้าวดัดแปลงพันธุกรรมที่ได้รับยีน OsC1 และ OsB2 แสดงว่าอาจมียีนแทรกในจีโนมข้าว 1 หรือ 2 ตำแหน่ง และพบอัตราส่วน 9 : 3 : 3 : 1 ในต้นข้าวดัดแปลงพันธุกรรมที่ได้รับยีนร่วมระหว่าง OsC1 ร่วมกับยีน OsB2 แสดงว่ามียีนแทรกในจีโนมข้าว 2 ตำแหน่ง จากการสร้างข้าวลูกผสมโดยผสมต้นข้าวดัดแปลงพันธุกรรมที่มียีน OsC1 เป็นต้นแม่ กับต้นที่มียีน OsB2 เป็นต้นพ่อ พบว่าได้ลูก F1 ที่มียีน OsC1 ร่วมกับยีน OsB2 เมื่อนำมาตรวจสอบด้วยเทคนิคพีซีอาร์ พบว่ามีต้นที่ได้รับยีนร่วมจำนวน 8 ต้น โดยมีฟีโนไทป์สีม่วงทั้งต้นซึ่งเกิดจากการสะสมแอนโทไซยานิน นอกจากนี้เมื่อวิเคราะห์การแสดงออกของยีนด้วยเทคนิค semi-quantitative RT-PCR พบว่าต้นข้าวรุ่น T1 ที่ได้รับยีน OsC1, OsB2 ยีนร่วม และลูกผสม F1 มีการแสดงออกของยีน OsC1 OsB2 และยีนโครงสร้างที่สำคัญในวิถีการสังเคราะห์แอนโทไซยานินสูงกว่าต้นข้าวที่ไม่ผ่านการถ่ายยีน เมล็ดแก่ของข้าวดัดแปลงพันธุกรรมรุ่น T1 ที่ได้รับยีน OsB2 มีปริมาณแอนโทไซยานินและฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระสูงกว่าเมล็ดแก่ของข้าวที่ไม่ผ่านการถ่ายยีน ข้าวดัดแปลงพันธุกรรมที่ได้รับยีน OsC1 และข้าวที่ได้รับยีนร่วม งานวิจัยนี้สามารถใช้ยีนควบคุมการสังเคราะห์แอนโทไซยานินเป็นยีนคัดเลือกหรือยีนเครื่องหมายในขั้นตอนการถ่ายยีนเข้าสู่แคลลัสข้าว และนำไปพัฒนาในการปรับปรุงพันธุ์เพื่อให้ได้ข้าวพันธุ์ดีที่มีแอนโทไซยานินสูงในอนาคต